Lựa chọn các gen housekeeping ở cừu để chuẩn hóa bằng RT-PCR thời gian thực; phân tích biểu hiện gen PrP và độ nhạy di truyền đối với bệnh scrapie

Springer Science and Business Media LLC - Tập 1 Số 1 - 2005
David Garcia-Crespo1, Ramón A. Juste1, Ana Hurtado1
1Department of Animal Health, Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER), Berreaga, 1, 48160, Derio, Bizkaia, Spain

Tóm tắt

Tóm tắt Đặt vấn đề

Biểu hiện của protein prion tế bào là điều cần thiết cho sự phát triển của các bệnh não xốp lây truyền (TSEs), và ở cừu, độ nhạy di truyền với scrapie đã được liên kết với các đa hình gene PrP. Để kiểm tra mối liên kết giả thuyết giữa biểu hiện gene PrP và độ nhạy di truyền, mức độ mRNA PrP đã được đo bằng phương pháp RT-PCR thời gian thực trong sáu mô cừu của các động vật có kiểu gen khác nhau.

 Kết quả

Trước khi phân tích biểu hiện gene PrP, tính ổn định của nhiều gene housekeeping (HK) đã được đánh giá để chọn ra những gene tốt nhất cho việc định lượng tương đối. Việc chuẩn hóa biểu hiện gene được thực hiện bằng cách sử dụng ít nhất ba gene HK để phát hiện những sự khác biệt nhỏ trong biểu hiện chính xác hơn so với việc sử dụng một gene đối chứng duy nhất. Phân tích độ ổn định biểu hiện của sáu gene HK cho thấy một sự biến động lớn liên quan đến mô phản ánh sự tồn tại của các yếu tố đặc hiệu với mô. Do đó, một tập hợp cụ thể các gene HK là cần thiết cho việc chuẩn hóa chính xác biểu hiện gene PrP trong mỗi mô. Những sự khác biệt thống kê trong mức độ mRNA PrP đã được chuẩn hóa được tìm thấy giữa các mô, với mức biểu hiện cao nhất ở obex, tiếp theo là ileum, hạch bạch huyết, lách, tiểu não và đại não. Một xu hướng về mức độ mRNA PrP cao hơn và độ nhạy di truyền đã được quan sát thấy ở hệ thần kinh trung ương. Tuy nhiên, các kết quả không ủng hộ giả thuyết rằng mức độ mRNA PrP thay đổi giữa các kiểu gen.

 Kết luận

Các kết quả về biểu hiện gene PrP được trình bày ở đây cung cấp dữ liệu cơ bản quý giá cho các nghiên cứu trong tương lai về cơ chế bệnh sinh của scrapie. Mặt khác, các kết quả về dữ liệu ổn định của nhiều gene HK được báo cáo trong nghiên cứu này có thể rất hữu ích trong các nghiên cứu biểu hiện gene khác được thực hiện trên các mô cừu có liên quan này.

Từ khóa


Tài liệu tham khảo

Hunter N: Scrapie. Mol Biotechnol. 1998, 9: 225-234.

Prusiner SB: Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95: 13363-13383. 10.1073/pnas.95.23.13363.

Brandner S, Raeber AJ, Sailer A, Blattler T, Fischer M, Weissmann C, Aguzzi A: Normal host prion protein (PrPc) is required for scrapie spread within the central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996, 93: 13148-13151. 10.1073/pnas.93.23.13148.

Blattler T, Brandner S, Raeber AJ, Klein MA, Voigtlander T, Weissmann C, Aguzzi A: PrP-expressing tissue required for transfer of scrapie infectivity from spleen to brain. Nature. 1997, 389: 69-73. 10.1038/37981.

Hunter N, Foster JD, Dickinson AG, Hope J: Linkage of the gene for the scrapie-associated fibril protein (PrP) to the Sip gene in Cheviot sheep. Vet Rec. 1989, 124: 364-366.

Belt PB, Muileman IH, Schreuder BE, Bos-de RJ, Gielkens AL, Smits MA: Identification of five allelic variants of the sheep PrP gene and their association with natural scrapie. J Gen Virol. 1995, 76: 509-517.

UKNational Scrapie Plan risk groups. 2003, [http://www.defra.gov.uk/nsp]

Bossers A, de Vries R, Smits MA: Susceptibility of sheep for scrapie as assessed by in vitro conversion of nine naturally occurring variants of PrP. J Virol. 2000, 74: 1407-1414. 10.1128/JVI.74.3.1407-1414.2000.

Sabuncu E, Petit S, Le Dur A, Lan LT, Vilotte JL, Laude H, Vilette D: PrP polymorphisms tightly control sheep prion replication in cultured cells. J Virol. 2003, 77: 2696-2700. 10.1128/JVI.77.4.2696-2700.2003.

Maignien T, Lasmezas C, Beringue V, Dormont D, Deslys JP: Pathogenesis of the oral route of infection of mice with scrapie and bovine spongiform encephalopathy agents. J Gen Virol. 1999, 80: 3035-3042.

van Keulen LJ, Vromans ME, van Zijderveld FG: Early and late pathogenesis of natural scrapie infection in sheep. APMIS. 2002, 110: 23-32. 10.1034/j.1600-0463.2002.100104.x.

Tichopad A, Pfaffl MW, Didier A: Tissue-specific expression pattern of bovine prion gene: quantification using real-time RT-PCR. Mol Cell Probes. 2003, 17: 5-10. 10.1016/S0890-8508(02)00114-7.

Ning ZY, Zhao DM, Yang JM, Cui YL, Meng LP, Wu CD, Liu HX: Quantification of prion gene expression in brain and peripheral organs of golden hamster by real-time RT-PCR. Anim Biotechnol. 2005, 16: 55-65.

Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM: Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996, 6: 986-994.

Bustin SA: Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol. 2002, 29: 23-39. 10.1677/jme.0.0290023.

Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F: Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002, 3: research0034.1-0034.12. 10.1186/gb-2002-3-7-research0034.

Laud K, Hornez L, Gourdou I, Belair L, Arnold A, Peyrat JP, Djiane J: Expression of BRCA1 gene in ewe mammary epithelial cells during pregnancy: regulation by growth hormone and steroid hormones. Eur J Endocrinol. 2001, 145: 763-770. 10.1530/eje.0.1450763.

Grubor B, Gallup JM, Ramirez-Romero R, Bailey TB, Crouch EC, Brogden KA, Ackermann MR: Surfactant protein D expression in normal and pneumonic ovine lung. Vet Immunol Immunopathol. 2004, 101: 235-242. 10.1016/j.vetimm.2004.05.004.

Hein WR, Barber T, Cole SA, Morrison L, Pernthaner A: Long-term collection and characterization of afferent lymph from the ovine small intestine. J Immunol Methods. 2004, 293: 153-168. 10.1016/j.jim.2004.07.008.

Thellin O, Zorzi W, Lakaye B, De Borman B, Coumans B, Hennen G, Grisar T, Igout A, Heinen E: Housekeeping genes as internal standards: use and limits. J Biotechnol. 1999, 75: 291-295. 10.1016/S0168-1656(99)00163-7.

Warrington JA, Nair A, Mahadevappa M, Tsyganskaya M: Comparison of human adult and fetal expression and identification of 535 housekeeping/maintenance genes. Physiol Genomics. 2000, 2: 143-147.

Tichopad A, Didier A, Pfaffl MW: Inhibition of real-time RT-PCR quantification due to tissue-specific contaminants. Mol Cell Probes. 2004, 18: 45-50. 10.1016/j.mcp.2003.09.001.

Yperman J, De Visscher G, Holvoet P, Flameng W: Beta-actin cannot be used as a control for gene expression in ovine interstitial cells derived from heart valves. J Heart Valve Dis. 2004, 13: 848-853.

Hunter N, Manson JC, Charleson FC, Hope J: Comparison of expression patterns of PrP mRNA in the developing sheep and mouse. Ann N Y Acad Sci. 1994, 724: 353-354.

Horiuchi M, Yamazaki N, Ikeda T, Ishiguro N, Shinagawa M: A cellular form of prion protein (PrPC) exists in many non-neuronal tissues of sheep. J Gen Virol. 1995, 76: 2583-2587.

Goldmann W, O'Neill G, Cheung F, Charleson F, Ford P, Hunter N: PrP (prion) gene expression in sheep may be modulated by alternative polyadenylation of its messenger RNA. J Gen Virol. 1999, 80: 2275-2283.

Moudjou M, Frobert Y, Grassi J, La Bonnardiere C: Cellular prion protein status in sheep: tissue-specific biochemical signatures. J Gen Virol. 2001, 82: 2017-2024.

Halliday S, Houston F, Hunter N: Expression of PrPC on cellular components of sheep blood. J Gen Virol. 2005, 86: 1571-1579. 10.1099/vir.0.80561-0.

McCutcheon S, Hunter N, Houston F: Use of a new immunoassay to measure PrP(Sc) levels in scrapie-infected sheep brains reveals PrP genotype-specific differences. J Immunol Methods. 2005, 298: 119-128. 10.1016/j.jim.2005.01.012.

Garcia-Crespo D, Oporto B, Gomez N, Nagore D, Benedicto L, Juste RA, Hurtado A: PrP polymorphisms in Basque sheep breeds determined by PCR-restriction fragment length polymorphism and real-time PCR. Vet Rec. 2004, 154: 717-722.

Rasmussen R: Quantification on the LightCycler instrument. Rapid Cycle Real-time PCR, Methods and Applications. Edited by: Meuer S, Wittwer C and Nakagawara K. Heidelberg, Springer-Verlag Press; 2001:21-34.

Thông tin
Thông tin xuất bản

Springer Science and Business Media LLC

Tập 1 Số 1

Thông tin tác giả