Thay thế gen Streptomyces nhắm vào PCR xác định miền protein cần thiết cho tổng hợp mùi đất sesquiterpene geosmin

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - Tập 100 Số 4 - Trang 1541-1546 - 2003
Bertolt Gust1, Gregory L. Challis1, Kay Fowler1,2, Tobias Kieser1, Keith Chater1
1Department of Molecular Microbiology, John Innes Centre, Colney, Norwich NR4 7UH, United Kingdom; and Department of Chemistry, University of Warwick, Coventry CV4 7AL, United Kingdom
2Quadram Institute Bioscience

Tóm tắt

Streptomycetes là những vi khuẩn đất hình sợi, Gram dương giàu G+C, có khả năng sản sinh kháng sinh. Bộ gen Streptomyces coelicolor dài 8,7 Mb đã được giải mã trước đó bằng cách sử dụng một thư viện có thứ tự các bản sao Supercos-1. Ở đây, chúng tôi mô tả một quy trình hiệu quả để tạo ra những thay thế gen chính xác trong các bản sao cosmid bằng cách sử dụng kỹ thuật nhắm PCR và tái tổ hợp qua trung gian λ-Red. Các gen Streptomyces được thay thế bằng một băng cassette chứa khả năng kháng thuốc kháng sinh có thể lựa chọn và oriTRK2 để chuyển giao hiệu quả vào Streptomyces thông qua sự giao hợp liên gene do RP4 điều khiển. Supercos-1 không nhân lên trong Streptomyces, nhưng các bản sao dễ dàng trải qua tái tổ hợp double-crossover, từ đó tạo ra các thay thế gen. Các băng cassette kháng sinh được bao quanh bởi các chuỗi đích của FLP recombinase từ nấm men để loại bỏ khả năng kháng kháng sinh và oriTRK2 nhằm tạo ra các đột biến không có dấu hiệu, không phân cực. Kỹ thuật này đã được hơn 20 nhà nghiên cứu sử dụng thành công để đột biến khoảng 100 gen Streptomyces. Như một ví dụ, chúng tôi mô tả việc áp dụng nó vào việc phát hiện một gen liên quan đến sản xuất geosmin, mùi đặc trưng của đất. Gen này, Sco6073 (cyc2), mã hóa cho một protein có hai miền synthase sesquiterpene, chỉ một trong số đó là cần thiết cho tổng hợp geosmin, có thể thông qua một trung gian germacra-1 (10)E,5E-dien-11-ol được tạo ra bởi synthase sesquiterpene từ farnesyl pyrophosphate.

Từ khóa


Tài liệu tham khảo

10.1038/417141a

10.1073/pnas.120163297

T Kieser, M J Bibb, M J Buttner, K F Chater, D A Hopwood Practical Streptomyces Genetics (John Innes Foundation, Norwich, U.K., 2000).

10.1038/82449

J P Muyrers, Y Zhang, A F Stewart Genet Eng 22, 77–98 (2000).

10.1016/S0378-1119(00)00071-8

10.1093/nar/27.6.1555

10.1038/2417

10.1128/JB.180.8.2063-2071.1998

10.1046/j.1365-2958.1996.6191336.x

10.1016/0378-1119(95)00193-A

10.3109/10408417909082014

10.1128/am.13.6.935-938.1965

10.1021/jf0116754

10.1002/1521-4028(200103)41:1<51::AID-JOBM51>3.0.CO;2-R

10.1055/s-2006-960983

H Kiviranta, A Tuomainen, M Reiman, S Laitinen, J Liesivuori, A Nevalainen Cent Eur J Public Health 6, 296–299 (1998).

Dionigi C. P. (1993) Food Flavour Safety 322–377.

S Wood, S T Williams, W R White Int Biodeterior Bull 19, 83–97 (1983).

10.1016/0014-5793(81)80723-5

10.1021/bi00185a024

10.1073/pnas.0337625100

10.1128/JB.181.1.204-211.1999

10.1016/0378-1119(88)90419-2

10.1016/0378-1119(92)90627-2

10.1128/aem.62.4.1295-1299.1996

10.1073/pnas.100127597

10.1046/j.1365-2958.1999.01630.x

10.1016/0378-1119(92)90603-M

10.1111/j.1574-6968.1997.tb13882.x

10.1046/j.1365-2958.2002.03004.x

10.1093/nar/28.22.e97

10.1016/0378-1119(94)90831-1

K Fowler Ph.D. thesis (John Innes Centre, Norwich, U.K., 2002).

10.1042/bj20011380

10.1126/science.277.5333.1820

Thông tin
Thông tin xuất bản

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America

Tập 100 Số 4

1541-1546

Thông tin tác giả