Tối ưu hóa định danh ADN của trứng Toxocara spp. trong mẫu đất và cát

Parasites and Vectors - 2021
Wojciech Jarosz1, Jean-François Durant2, Léonid M. Irenge2, Renata Fogt-Wyrwas1, Hanna Mizgajska-Wiktor1, Jean‐Luc Gala2
1Department of Biology and Anatomy, Faculty of Health Sciences, Poznań University of Physical Education, Królowej Jadwigi 27/39, 61-871, Poznan, Poland
2Center for Applied Molecular Technologies, Institute of Clinical and Experimental Research, Université Catholique de Louvain, Tour Claude Bernard, Avenue Hippocrate 54-55, 1st Floor, B1.54.01, 1200, Brussels, Belgium

Tóm tắt

Abstract Nền tảng

Toxocara canis và Toxocara cati là loài giun đũa phân bố trên toàn cầu và là nguyên nhân gây ra bệnh xoắn khuẩn ở người, thông qua việc hấp thụ trứng Toxocara. Kiểm soát nhiễm Toxocara bị hạn chế do thiếu các phương pháp nhạy để sàng lọc phân động vật và các mẫu môi trường có thể bị nhiễm trứng Toxocara. Trong công trình này, một phương pháp tiền phân tích để tách chiết ADN từ trứng Toxocara trong các mẫu môi trường hiệu quả đã được thiết lập sử dụng phương pháp chuỗi phản ứng polymerase định lượng thời gian thực đặc hiệu cho T. canis và T. cati mà chúng tôi đã xác nhận trước đó. Để làm điều này, ảnh hưởng của các phương pháp khác nhau để phá vỡ trứng, tách chiết và làm sạch ADN nhằm loại bỏ chất ức chế PCR đã được đánh giá trên các mẫu môi trường.

 Phương pháp

Để chọn lựa phương pháp phá vỡ trứng tốt nhất, sáu giao thức đã được so sánh trên các hỗn dịch trứng T. canis thuần, bao gồm phân giải bằng enzym và phá vỡ nhiệt hoặc cơ học. Dựa trên phương pháp tốt nhất được chọn, một quy trình phân tích được thiết lập để so sánh hai phương pháp tách chiết ADN (Bộ Kit FastDNA™ SPIN cho đất và Bộ Kit DNeasy® PowerMax® cho đất) với bước pha loãng và/hoặc làm sạch tùy chọn (Agencourt® AMPure®). Quy trình này được đánh giá trên các mẫu đất 10-g và cát 10-g đã được thêm vào các hỗn dịch trứng của T. canis (pha loãng gấp mười lần 104 trứng theo từng bộ ba). Khả năng của các phương pháp khác nhau, được sử dụng riêng biệt hoặc kết hợp, để tăng tỷ lệ các xét nghiệm dương tính đã được đánh giá. Quy trình tối ưu cho việc xử lý các mẫu đất đã được thêm vào trứng được thử nghiệm trên các mẫu đất môi trường và so sánh với phương pháp nổi ly tâm và quan sát bằng kính hiển vi trứng Toxocara.

 Kết quả

Phương pháp tách chiết ADN hiệu quả nhất cho trứng Toxocara trong mẫu đất bao gồm việc kết hợp phá vỡ cơ học trứng bằng hạt, sau đó là tách chiết ADN với Bộ Kit DNeasy® PowerMax® cho đất, và hoàn tất với bước làm sạch ADN bổ sung với hạt AMPure® và pha loãng ADN mẫu (1:10). Quy trình này cho thấy giới hạn phát hiện là 4 trứng T.canis trong mẫu cát 10-g và 46 trứng trong mẫu đất 10-g.

 Kết luận

Quy trình tiền phân tích phát triển ở đây kết hợp với qPCR đại diện cho một phương pháp giám sát cải tiến, có khả năng tự động hóa và hiệu quả về chi phí, để giám sát sự ô nhiễm Toxocara trong môi trường.

 Đồ họa Tóm tắt

Từ khóa

#Toxocara #ADN #phân tích #môi trường #qPCR #tách chiết #trứng giun đũa #môi trường #ô nhiễm

Tài liệu tham khảo

Chen J, Zhou DH, Nisbet AJ, Xu MJ, Huang SY, Li MW, et al. Advances in molecular identification, taxonomy, genetic variation and diagnosis of Toxocara spp. Infect Genet Evol. 2012;12:1344–8.

Holland CV. Knowledge gaps in the epidemiology of Toxocara: the enigma remains. Parasitology. 2017;144:81–94.

Chen J, Liu Q, Liu GH, Zheng WB, Hong SJ, Sugiyama H, et al. Toxocariasis: a silent threat with a progressive public health impact. Infect Dis Poverty. 2018;7:59.

Macpherson CN. The epidemiology and public health importance of toxocariasis: a zoonosis of global importance. Int J Parasitol. 2013;43:999–1008.

Overgaauw PA. Aspects of Toxocara epidemiology: human toxocarosis. Crit Rev Microbiol. 1997;23:215–31.

Durant JF, Irenge LM, Fogt-Wyrwas R, Dumont C, Doucet JP, Mignon B, et al. Duplex quantitative real-time PCR assay for the detection and discrimination of the eggs of Toxocara canis and Toxocara cati (Nematoda, Ascaridoidea) in soil and fecal samples. Parasit Vectors. 2012;5:288.

Tyungu DL, McCormick D, Lau CL, Chang M, Murphy JR, Hotez PJ, et al. Toxocara species environmental contamination of public spaces in New York City. PLoS Negl Trop Dis. 2020;14:e0008249.

Amoah ID, Singh G, Stenstrom TA, Reddy P. Detection and quantification of soil-transmitted helminths in environmental samples: a review of current state-of-the-art and future perspectives. Acta Trop. 2017;169:187–201.

Umhang G, Bastien M, Renault C, Faisse M, Caillot C, Boucher JM, et al. A flotation/sieving method to detect Echinococcus multilocularis and Toxocara spp. eggs in soil by real-time PCR. Parasite. 2017;24:28.

Mizgajska H. Eggs of Toxocara spp. in the environment and their public health implications. J Helminthol. 2001;75:147–51.

Mizgajska-Wiktor H. Recommended method for recovery of Toxocara and other geohelminth eggs from soil. Wiad Parazytol. 2005;51:21–2.

Pabinger S, Rodiger S, Kriegner A, Vierlinger K, Weinhausel A. A survey of tools for the analysis of quantitative PCR (qPCR) data. Biomol Detect Quantif. 2014;1:23–33.

Armbruster DA, Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin Biochem Rev. 2008;29(Suppl 1):S49-52.

Phasuk N, Kache R, Thongtup K, Boonmuang S, Punsawad C. Soil contamination with Toxocara eggs in public schools in rural areas of southern Thailand. J Trop Med. 2020;2020:9659640.

Azam D, Ukpai OM, Said A, Abd-Allah GA, Morgan ER. Temperature and the development and survival of infective Toxocara canis larvae. Parasitol Res. 2012;110:649–56.

Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 2012;113:1014–26.

Thông tin
Thông tin xuất bản

Parasites and Vectors

Thông tin tác giả