Xóa bỏ một bước các gen nhiễm sắc thể trong Escherichia coli K-12 bằng cách sử dụng sản phẩm PCR

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - Tập 97 Số 12 - Trang 6640-6645 - 2000
Kirill A. Datsenko1, Barry L. Wanner2
1Department of Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette, IN 47907, USA
2§Department of Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette, IN 47907

Tóm tắt

Chúng tôi đã phát triển một phương pháp đơn giản và hiệu quả cao để xóa bỏ các gen nhiễm sắc thể trong Escherichia coli mà trong đó các mồi PCR cung cấp sự đồng đồng nội cho các gen mục tiêu. Trong quy trình này, sự tái tổ hợp yêu cầu enzym tái tổ hợp phage λ Red, được tổng hợp dưới sự kiểm soát của một promoter có thể kích hoạt trên một plasmid mang số lượng bản sao thấp và dễ tháo bỏ. Để chứng minh tính khả thi của phương pháp này, chúng tôi đã tạo ra các sản phẩm PCR bằng cách sử dụng các mồi có độ dài 36- đến 50-nucleotide nối với các vùng liền kề gen cần inactivate và các plasmid khuôn mang các gen kháng sinh được bao quanh bởi các vị trí FRT (đích nhận diện FLP). Bằng cách sử dụng các sản phẩm PCR tương ứng, chúng tôi đã thực hiện 13 sự phá vỡ khác nhau của các gen nhiễm sắc thể. Các đột biến của arcB, cyaA, lacZYA, ompR-envZ, phnR, pstB, pstCA, pstS, pstSCAB-phoU, recA, và torSTRCAD đã được phân lập dưới dạng các thuộc địa kháng sinh sau khi đưa vào vi khuẩn mang plasmid biểu hiện Red DNA tổng hợp (tạo ra bằng PCR). Các gen kháng thuốc sau đó được loại bỏ bằng cách sử dụng một plasmid hỗ trợ mã hóa FLP tái tổ hợp, cũng dễ dàng tháo bỏ. Quy trình này nên được áp dụng rộng rãi, đặc biệt trong phân tích gen của E. coli và các vi khuẩn khác vì quy trình này có thể được thực hiện trong các tế bào kiểu hoang.

Từ khóa


Tài liệu tham khảo

10.1128/jb.171.5.2609-2613.1989

10.1128/jb.171.9.4617-4622.1989

10.1006/plas.1996.0001

10.1128/jb.179.20.6228-6237.1997

10.1093/genetics/145.4.877

10.1271/bbb.62.1826

10.1093/nar/27.22.4409

10.1093/nar/21.14.3329

10.1016/S0167-7799(98)01214-1

10.1128/JB.181.6.1868-1874.1999

10.1128/mr.58.3.563-602.1994

10.1073/pnas.70.1.84

10.3109/10408419409113552

10.1128/jb.161.3.1219-1221.1985

10.1073/pnas.83.15.5558

10.1128/jb.167.2.594-603.1986

10.1128/mr.52.1.1-28.1988

10.1128/JB.180.8.2063-2071.1998

10.1038/2417

B L Wanner Methods in Molecular Genetics, ed K W Adolph (Academic, Orlando, FL) 3, 291–310 (1994).

10.1093/genetics/96.2.353

10.1016/S0022-2836(83)80284-8

10.1016/S0022-2836(83)80086-2

10.1128/jb.179.18.5903-5913.1997

10.1128/JB.180.5.1277-1286.1998

10.1016/0378-1119(95)00193-A

10.1128/jb.172.6.3191-3200.1990

10.1093/nar/22.12.2392

10.1016/0378-1119(94)90856-7

10.1128/jb.177.14.4121-4130.1995

10.1016/0022-2836(79)90426-1

10.1128/jb.177.22.6411-6421.1995

10.1126/science.277.5331.1453

B L Wanner Escherichia coli and Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology, eds F C Neidhardt, R Curtiss, J L Ingraham, E C C Lin, K B Low, B Magasanik, W S Reznikoff, M Riley, M Schaechter, H E Umbarger (Am. Soc. Microbiol., Washington, DC), pp. 1357–1381 (1996).

10.1007/BF00266619

10.1128/jb.94.4.1268-1269.1967

10.1016/0378-1119(81)90079-2

D Court, A Oppenheim Lambda II, eds R W Hendrix, J W Roberts, F W Stahl, R A Weisberg (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), pp. 251–277 (1983).

10.1093/nar/23.11.1841

10.1093/nar/27.2.389

Thông tin
Thông tin xuất bản

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America

Tập 97 Số 12

6640-6645

Thông tin tác giả