Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Tiến hóa trong phòng thí nghiệm enzyme alcohol dehydrogenase của Pyrococcus furiosus để cải thiện sản xuất (2S,5S)-hexanediol ở nhiệt độ vừa phải
Tóm tắt
Nghiên cứu về việc sử dụng enzyme alcohol dehydrogenases chọn lọc đối xứng để sản xuất các diol tinh khiết về đối xứng và diastereoisomer, những thành phần quan trọng trong dược phẩm, hóa chất nông nghiệp và hóa chất tinh. Do nhu cầu về một enzyme alcohol dehydrogenase ổn định với hoạt tính ở điều kiện nhiệt độ thấp (30°C) cho sản xuất (2S,5S)-hexanediol, chúng tôi đã cải tiến enzyme alcohol dehydrogenase từ sinh vật cổ đại siêu nhiệt Pyrococcus furiosus (AdhA). Một enzyme alcohol dehydrogenase S-chọn lọc ổn định được tạo ra với hoạt tính gia tăng ở 30°C trên cơ chất 2,5-hexanedione thông qua tiến hóa trong phòng thí nghiệm trên enzyme alcohol dehydrogenase AdhA ổn định nhiệt. Một vòng PCR với tỷ lệ sai sót và sàng lọc khoảng 1.500 biến thể đã được thực hiện. Hoạt tính đặc hiệu tối đa của biến thể hoạt động tốt nhất với 2,5-hexanedione ở 30°C cao gấp mười lần so với hoạt tính của enzyme loại hoang dã. Một mô hình 3D của AdhA cho thấy rằng biến thể này có một đột biến ở vị trí liên kết NADP(H) được bảo tồn tốt (R11L), và một đột biến thứ hai (A180V) gần với threonine xúc tác và được bảo tồn cao tại vị trí 183.
Từ khóa
Tài liệu tham khảo
Bastos FM, Dos Santos AG, Jones J, Oestreicher EG, Pinto GF, Paiva LMC (1999) Three different coupled enzymatic systems for in situ regeneration of NADPH. Biotechnol Tech 13:661–664
Bornscheuer UT, Pohl M (2001) Improved biocatalysts by directed evolution and rational protein design. Curr Opin Chem Biol 5:137–143
Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248–254
Breton R, Housset D, Mazza C, Fontecilla-Camps JC (1996) The structure of a complex of human 17-β-hydroxysteroid dehydrogenase with estradiol and NADP+ identifies two principal targets for the design of inhibitors. Structure 4:905–915
Brunel JM, Faure B (2004) Enantioselective palladium catalyzed allylic substitution with a new phosphite ligand issued from (2S,5S)-hexanediol. J Mol Catal A Chem 212:61–64
Cadwell RC, Joyce GF (1992) Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods Appl 2:28–33
Eckstein M, Dauβmann T, Kragl U (2004) Recent Developments in NAD(P)H regeneration for enzymatic reductions in one- and two-phase systems. Biocatal Biotransform 22:89–96
Fiala G, Stetter KO (1986) Pyrococcus furiosus sp. nov. represents a novel genus of marine heterotrophic archaebacteria growing optimally at 100°C. Arch Microbiol 145:56–61
Filling C, Berndt KD, Benach J, Knapp S, Prozorovski T, Nordling E, Ladenstein R, Jörnvall H, Oppermann U (2002) Critical residues for structure and catalysis in short-chain dehydrogenases/reductases. J Biol Chem 277:25677–25684
Haberland J, Hummel W, Daussmann T, Liese A (2002a) New continuous production for enantiopure (2R,5R)-hexanediol. Org Process Res Dev 6:458–462
Haberland J, Kriegesmann A, Wolfram E, Hummel W, Liese A (2002b) Diastereoselective synthesis of optically active (2R,5R)-hexanediol. Appl Microbiol Biotechnol 58:595–599
Hooft RW, Vriend G, Sander C, Abola EE (1996) Errors in protein structures. Nature 381(6580):272
Hummel W (1999) Large-scale applications of NAD(P)-dependent oxidoreductases: recent developments. Trends Biotechnol 17:487–492
Karshikoff A, Ladenstein R (2001) Ion pairs and the thermotolerance of proteins from hyperthermophiles: a “traffic rule” for hot roads. Trends Biochem Sci 26:550–556
Kim R, Sandler SJ, Goldman S, Yokota H, Clark AJ, Kim SH (1998) Overexpression of archaeal proteins in Escherichia coli. Biotechnol Lett 20:207–210
Lebbink JHG, Kaper T, Bron P, Van der Oost J, De Vos WM (2000) Improving low-temperature catalysis in the hyperthermostable Pyrococcus furiosus β-glucosidase CelB by directed evolution. Biochemistry 39:3656–3665
Leung DW, Chen E, Goeddel DV (1989) A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction. Technique 1:11–15
Liang ZX, Tsigos I, Bouriotis V, Klinman JP (2004) Impact of protein flexibility on hydride-transfer parameters in thermophilic and psychrophilic alcohol dehydrogenases. J Am Chem Soc 126:9500–9501
Lieser JK (1983) A simple synthesis of (S,S)-2,5-hexanediol. Synth Commun 13:765–767
MacKenzie AK, Kershaw NJ, Hernandez H, Robinson CV, Schofield CJ, Andersson I (2007) Clavulanic acid dehydrogenase: structural and biochemical analysis of the final step in the biosynthesis of the beta-lactamase inhibitor clavulanic acid. Biochemistry 46:1523–1533
Mazza C, Breton R, Housset D, Fontecilla-Camps JC (1998) Unusual charge stabilization of NADP+ in 17-β-hydroxysteroid dehydrogenase. J Biol Chem 273:8145–815
Radianingtyas H, Wright PC (2003) Alcohol dehydrogenases from thermophilic and hyperthermophilic archaea and bacteria. FEMS Microbiol Rev 27:593–616
Reid MF, Fewson CA (1994) Molecular characterization of microbial alcohol dehydrogenases. Crit Rev Microbiol 20:13–56
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor
Schmid A, Dordick JS, Hauer B, Kiener A, Wubbolts M, Witholt B (2001) Industrial biocatalysis today and tomorrow. Nature 409:258–268
Schoemaker HE, Mink D, Wubbolts MG (2003) Dispelling the myths - biocatalysis in industrial synthesis. Science 299:1694–1697
Schwede T, Kopp J, Guex N, Peitsch MC (2003) SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Res 31:3381–3385
Shiraki K, Nishikori S, Fujiwara S, Hashimoto H, Kai Y, Takagi M, Imanaka T (2001) Comparative analyses of the conformational stability of a hyperthermophilic protein and its mesophilic counterpart. Eur J Biochem 268:4144–4150
Sorensen HP, Sperling-Petersen HU, Mortensen KK (2003) Production of recombinant thermostable proteins expressed in Escherichia coli: completion of protein synthesis is the bottleneck. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 786:207–214
Supangat S, Seo KH, Choi YK, Park YS, Son D, Han CD, Lee KH (2006) Structure of Chlorobium tepidum sepiapterin reductase complex reveals the novel substrate binding mode for stereospecific production of l-threo-tetrahydrobiopterin. J Biol Chem 281:2249–2256
Van der Oost J, Voorhorst WG, Kengen SWM, Geerling ACM, Wittenhorst V, Gueguen Y, De Vos WM (2001) Genetic and biochemical characterization of a short-chain alcohol dehydrogenase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus. Eur J Biochem 268:3062–3068
Vieille C, Zeikus GJ (2001) Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microbiol Mol Biol Rev 65:1–43
Wierenga RK, Terpstra P, Hol WG (1986) Prediction of the occurrence of the ADP-binding beta alpha beta-fold in proteins, using an amino acid sequence fingerprint. J Mol Biol 187:101–107
Yuan L, Kurek I, English J, Keenan R (2005) Laboratory-directed protein evolution. Microbiol Mol Biol Rev 69:373–392
Zeikus JG, Vieille C, Savchenko A (1998) Thermozymes: biotechnology and structure-function relationships. Extremophiles 2:179–183
