Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Các promoter U6 dị hợp và nội sinh cho phép chỉnh sửa gen trung gian CRISPR/Cas9 trong Aspergillus niger
Tóm tắt
Cac promoter U6 đã được sử dụng cho việc phiên mã RNA hướng dẫn đơn (sgRNA) trong hệ thống chỉnh sửa gen bằng CRISPR/Cas9 liên quan đến các lặp ngắn đối xứng thường xuyên xen kẽ. Tuy nhiên, chưa có promoter U6 nào được xác định trong Aspergillus niger, một nền tảng công nghiệp quan trọng cho việc sản xuất axit hữu cơ và protein. Hai hệ thống CRISPR/Cas9 được thiết lập trong A. niger phụ thuộc vào promoter RNA polymerase II hoặc phiên mã in vitro để tổng hợp sgRNA, nhưng những cách tiếp cận này thường làm tăng nỗ lực sao chép và thao tác di truyền. Việc xác thực các promoter RNA polymerase II chức năng do đó là một nhu cầu cấp bách cho A. niger. Ở đây, chúng tôi đã phát triển một hệ thống CRISPR/Cas9 mới trong A. niger cho việc biểu hiện sgRNA, dựa trên một promoter U6 nội sinh và hai promoter U6 dị hợp. Ba promoter U6 được thử nghiệm đã cho phép phiên mã sgRNA và làm gián đoạn gen albA synthase polyketide trong A. niger. Hơn nữa, hệ thống này cho phép chuyển gen cực kỳ hiệu quả tại các vị trí genome mục tiêu trong A. niger bằng cách sử dụng DNA cho phép với các cánh tay đồng nhất ngắn chỉ 40-bp. Nghiên cứu này đã chứng minh rằng cả các promoter U6 dị hợp và nội sinh đều có chức năng cho việc biểu hiện sgRNA trong A. niger. Dựa trên kết quả này, một công cụ CRISPR/Cas9 mới và đơn giản đã được thiết lập trong A. niger, sẽ mang lại lợi ích cho phân tích chức năng gen trong tương lai và chỉnh sửa genome.
Từ khóa
#CRISPR/Cas9 #Aspergillus niger #U6 promoter #sgRNA #chỉnh sửa genTài liệu tham khảo
Papagianni M. Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger: biochemical aspects, membrane transport and modeling. Biotechnol Adv. 2007;25:244–63.
Meyer V, Wu B, Ram AF. Aspergillus as a multi-purpose cell factory: current status and perspectives. Biotechnol Lett. 2011;33:469–76.
Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 2014;157:1262–78.
Sander JD, Joung JK. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 2014;32:347–55.
Fuller KK, Chen S, Loros JJ, Dunlap JC. Development of the CRISPR/Cas9 system for targeted gene disruption in Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell. 2015;14:1073–80.
Meyer V, Arentshorst M, El-Ghezal A, Drews AC, Kooistra R, et al. Highly efficient gene targeting in the Aspergillus niger kusA mutant. J Biotechnol. 2007;128:770–5.
Liu R, Chen L, Jiang Y, Zhou Z, Zou G. Efficient genome editing in filamentous fungus Trichoderma reesei using the CRISPR/Cas9 system. Cell Discov. 2015;1:15007.
Zhang C, Meng X, Wei X, Lu L. Highly efficient CRISPR mutagenesis by microhomology-mediated end joining in Aspergillus fumigatus. Fungal Genet Biol. 2016;86:47–57.
Pohl C, Kiel JA, Driessen AJ, Bovenberg RA, Nygard Y. CRISPR/Cas9 based genome editing of Penicillium chrysogenum. ACS Synth Biol. 2016;10:1021.
Nodvig CS, Nielsen JB, Kogle ME, Mortensen UH. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS ONE. 2015;10:e0133085.
Sarkari P, Marx H, Blumhoff ML, Mattanovich D, Sauer M, et al. An efficient tool for metabolic pathway construction and gene integration for Aspergillus niger. Biores Technol. 2017;245:1327–33.
Kuivanen J, Wang YMJ, Richard P. Engineering Aspergillus niger for galactaric acid production: elimination of galactaric acid catabolism by using RNA sequencing and CRISPR/Cas9. Microb Cell Fact. 2016. https://doi.org/10.1186/s12934-016-0613-5.
Kuivanen J, Arvas M, Richard P. Clustered genes encoding 2-keto-l-gulonate reductase and l-idonate 5-dehydrogenase in the novel fungal d-glucuronic acid pathway. Front Microbiol. 2017;8:225.
Arazoe T, Miyoshi K, Yamato T, Ogawa T, Ohsato S, et al. Tailor-made CRISPR/Cas system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus. Biotechnol Bioeng. 2015;112:2543–9.
Katayama T, Tanaka Y, Okabe T, Nakamura H, Fujii W, et al. Development of a genome editing technique using the CRISPR/Cas9 system in the industrial filamentous fungus Aspergillus oryzae. Biotechnol Lett. 2016;38:637–42.
Schuster M, Schweizer G, Reissmann S, Kahmann R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genet Biol. 2016;89:3–9.
Liu Q, Gao R, Li J, Lin L, Zhao J, et al. Development of a genome-editing CRISPR/Cas9 system in thermophilic fungal Myceliophthora species and its application to hyper-cellulase production strain engineering. Biotechnol Biofuels. 2017;10:1.
Carvalho ND, Arentshorst M, Jin Kwon M, Meyer V, Ram AF. Expanding the ku70 toolbox for filamentous fungi: establishment of complementation vectors and recipient strains for advanced gene analyses. Appl Microbiol Biotechnol. 2010;87:1463–73.
Wanka F, Cairns T, Boecker S, Berens C, Happel A, et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 2016;89:72–83.
Hsu PD, Scott DA, Weinstein JA, Ran FA, Konermann S, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 2013;31:827–32.
Brow DA, Guthrie C. Spliceosomal Rna U6 Is remarkably conserved from yeast to mammals. Nature. 1988;334:213–8.
Nakade S, Tsubota T, Sakane Y, Kume S, Sakamoto N, et al. Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9. Nat Commun. 2014;5:5560.