Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Tăng cường sự bài tiết protein bằng cách tối ưu hóa tổng hợp protein: phân lập và đặc trưng các đột biến Escherichia coli với khả năng bài tiết alkaline phosphatase tăng lên
Tóm tắt
Sự quá biểu hiện của gen phoA Escherichia coli, mã hóa cho alkaline phosphatase, trên plasmid đa bản sao đã dẫn đến sự tích tụ của dạng tiền chất của alkaline phosphatase. Các tế bào đã mất khả năng sống sót với chu kỳ bán rã 60 phút và thể hiện độ nhạy cao với 1% natri dodecyl sulfate (SDS), cho thấy việc lắp ráp các protein bề mặt bị ảnh hưởng bởi sự quá biểu hiện của gen phoA. Từ những tế bào thể hiện tính kháng với 1% SDS, chúng tôi đã thu được 20 đột biến có khả năng bài tiết nhiều alkaline phosphatase hơn vào không gian periplasm. Ba đại diện của các đột biến này không tích tụ các phân tử tiền chất và bài tiết alkaline phosphatase gấp năm đến sáu lần so với các tế bào kiểu hoang dã mang plasmid phoA đa bản sao. Trong tất cả ba đột biến này, lượng bản sao phoA thấp hơn từ hai đến bốn lần so với các tế bào kiểu hoang dã, cho thấy khả năng bài tiết một lượng lớn alkaline phosphatase là do giảm tỷ lệ tổng hợp của sản phẩm gen phoA. Khi trình điều khiển phoA được thay thế bằng trình điều khiển tacI và mức độ biểu hiện của gen phoA được điều chỉnh bằng isopropyl-1-thio-β-d-galactoside, sự bài tiết alkaline phosphatase vào không gian periplasm giảm khi tỷ lệ tổng hợp sản phẩm gen phoA tăng vượt ngưỡng. Tất cả các kết quả này cho thấy rằng sự sản xuất quá mức của sản phẩm gen phoA gây ra các khuyết tật trong việc bài tiết alkaline phosphatase và rằng việc điều chỉnh mức độ biểu hiện là cần thiết cho chuyển giao hiệu quả.
Từ khóa
#Escherichia coli #alkaline phosphatase #gene expression #protein secretion #mutantsTài liệu tham khảo
Ames GF-L, Prody C, Kutsu S (1984) Simple, rapid, and quantitative release of periplasmic proteins by chloroform. J Bacteriol 160:1181–1183
Bushman FD, Ptashne M (1988) Turning λ Cro into a transcriptional activator. Cell 54:191–197
De Boer HA, Comstock LJ, Vassar M (1983) The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters. Proc Natl Acad Sci USA 80:21–25
Freudl R, Schwarz H, Stierhof YD, Gamon K, Hindennach I, Henning U (1986) An outer membrane protein (OmpA) of Escherichia coli K-12 undergoes a conformational change during export. J Biol Chem 261:11355–11361
Freudl R, Schwarz H, Kramps S, Hindennach I, Henning U (1988) Dihydrofolate reductase (mouse) and β-galactosidase (Escherichia coli) can be translocated across the plasma membrane of E. coli. J Biol Chem 263:17084–17091
Kadokura H, Yoda K, Imai M, Yamasaki M (1990) Production and secretion in Escherichia coli of hepatitis B virus Pre-S2 antigen as fusion proteins with β-lactamase. Appl Environ Microbiol 56:2742–2747
Kusukawa N, Yura T, Ueguchi C, Akiyama Y, Ito K (1989) Effects of mutations in heat-shock genes groES and groEL on protein export in Escherichia coli. EMBO J 8:3517–3521
Kreuzar K, Pratt C, Torriani A (1975) Genetic analysis of regulatory mutants of alkaline phosphatase of E. coli. Genetics 81:459–468
Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680–685
Lee C, Beckwith J (1986) Suppression of growth and protein secretion defects in Escherichia coli secA mutants by decreasing protein synthesis. J Bacteriol 166:878–883
Matsuyama S, Fujita Y, Mizushima S (1993) SecD is involved in the release of translocated secretory proteins from the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. EMBO J 12:265–270
Miller JH (1972) Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
Neidhardt FC, Bloch PL, Smith DF (1974) Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol 119:736–747
Oka T, Sakamoto S, Miyoshi K, Fuwa T, Yoda K, Yamasaki M, Tamura G, Miyake T (1985) Synthesis and secretion of human growth factor by Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 82:7212–7216
Pages J-M, Anba J, Bernadac A, Shinagawa H, Nakata A, Lazdunski C (1984) Normal precursors of periplasmic protiens accumalated in the cytoplasm are not exported post-translationally in Escherichia coli. Eur J Biochem 143:499–505
Reid TW, Wilson IB (1971) E. coli alkaline phosphatse. In: Boyer PD (ed) The enzymes, vol 4. Academic Press, New York, pp 373–415
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
Shiba K, Ito K, Yura T (1984) Mutation that suppresses the protein export defect of the secY mutation and causes cold-sensitive growth of Escherichia coli. J Bacteriol 160:696–701
Wanner BL (1987) Phosphate regulation of gene expression in Escherichia coli. In: Neidhardt FC, Ingraham J, Low KB, Magasanik B, Schaechter M, Umbarger HE (eds) Escherichia coli and Salmonella typhimurium; cellular and molecular biology. American Society for Microbiology, Washington, D.C., pp 1326–1333
Yamada M, Makino K, Amemura M, Shinagawa H, Nakata A (1989) Regulation of the phosphate regulon of Escherichia coli; analysis of mutant phoB and phoR genes causing different phenotypes. J Bacteriol 171:5601–5606
Yanisch-Perron C, Vieira J, Messing J (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33:103–119
Yoda K, Kikuchi Y, Yamasaki M, Tamura G (1980) Cloning of the structural gene of alkaline phosphatase of Escherichia coli K12. Agric Biol Chem 44:1213–1214
Yoda K, Tachibana K, Watanabe S, Yamane K, Yamasaki M, Tamura G (1987) Secretion to periplasm of foreign proteins in Escherichia coli by the aid of the phoA-derived secretion vector Psi. In: Torriani-Gorini A, Rothman FG, Silver S, Wright A, Yagil E (eds) Phosphate metabolism and cellular regulation in microorganisms. American Society for Microbiology, Washington, D.C., pp 99–104