Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Cải thiện sản xuất FK520 ở Streptomyces hygroscopicus bằng cách kết hợp đột biến truyền thống với kỹ thuật kỹ thuật sinh học
Tóm tắt
FK520 (ascomycin), một macrolide 23 thành viên có hoạt tính ức chế miễn dịch, được sản xuất bởi Streptomyces hygroscopicus. Vấn đề về năng suất thấp và tạp chất cao (chủ yếu là FK523) hạn chế sản xuất công nghiệp FK520. Trong nghiên cứu này, năng suất FK520 đã được cải thiện đáng kể thông qua đột biến chủng và kỹ thuật di truyền. Đầu tiên, một chủng sản xuất FK520 cao SFK-6-33 (2432,2 mg/L) đã được thu nhận từ SFK-36 (1588,4 mg/L) thông qua việc đột biến bằng bức xạ cực tím kết hợp với sàng lọc kháng streptomycin. Enzyme carboxylase/reductase crotonyl-CoA nội sinh (FkbS) được xác định có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp FK520, được xác định bằng hệ thống ức chế CRISPR/dCas9. FkbS đã được biểu hiện vượt mức trong SFK-6-33 để thu được chủng kỹ thuật SFK-OfkbS, chủng này sản xuất 2817,0 mg/L FK520 nhờ vào việc tăng cường nồng độ ethylmalonyl-CoA nội bào. Ngoài ra, nồng độ FK520 còn có thể tăng thêm khi bổ sung axit crotonic vào SFK-OfkbS. Việc biểu hiện vượt mức enzyme acety-CoA carboxylase (ACCase), được sử dụng để tổng hợp malonyl-CoA, cũng được nghiên cứu trong SFK-6-33, tăng năng suất FK520 lên 3320,1 mg/L nhưng không cho thấy sự ức chế đáng kể nào trong sản xuất FK523. Để nâng cao thêm sản xuất FK520, chủng biểu hiện kết hợp FkbS và ACCase SFK-OASN đã được xây dựng; sản xuất FK520 tăng lên 44,4% đạt 3511,4 mg/L, và tỷ lệ FK523/FK520 giảm từ 9,6% xuống 5,6% so với SFK-6-33. Cuối cùng, một văn hóa ba lát đã được thực hiện trong bể lên men 5-L, và năng suất FK520 đạt 3913,9 mg/L sau 168 giờ thông qua việc bổ sung glycerol, đại diện cho năng suất FK520 cao nhất được báo cáo cho đến nay. Những kết quả này cho thấy rằng đột biến truyền thống kết hợp với kỹ thuật sinh học là một chiến lược hiệu quả để cải thiện sản xuất FK520.
Từ khóa
#FK520 #Streptomyces hygroscopicus #kỹ thuật di truyền #macrolide #năng suất sản xuấtTài liệu tham khảo
Armando JW, Boghigian BA, Pfeifer BA (2012) LC-MS/MS quantification of short-chain acyl-CoA’s in Escherichia coli demonstrates versatile propionyl-CoA synthetase substrate specificity. Lett Appl Microbiol 54(2):140–148
Bérdy J (2005) Bioactive Microbial Metabolites. J Antibiot 58(1):1–26
Bierman M, Logan R, Obrien K, Seno ET, Rao RN, Schoner BE (1992) Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp. Gene 116(1):43–49
Chan YA, Podevels AM, Kevany BM, Thomas MG (2009) Biosynthesis of polyketide synthase extender units. Nat Prod Rep 26(1):90–114
Chen D, Zhang Q, Zhang Q, Cen P, Xu Z, Liu W (2012) Improvement of FK506 production in Streptomyces tsukubaensis by genetic enhancement of the supply of unusual polyketide extender units via utilization of two distinct site-specific recombination systems. Appl Environ Microbiol 78(15):5093–5103
Dunn BJ, Khosla C (2013) Engineering the acyltransferase substrate specificity of assembly line polyketide synthases. J R Soc Interface 10(85):20130297–20130297
Eichenfield LF, Lucky AW, Boguniewicz M, Langley RG, Cherill R, Marshall K, Bush C, Graeber M (2002) Safety and efficacy of pimecrolimus (ASM 981) cream 1% in the treatment of mild and moderate atopic dermatitis in children and adolescents. J Am Acad Dermatol 46(4):495–504
Jung WS, Yoo YJ, Park JW, Park SR, Han AR, Ban YH, Kim EJ, Kim E, Yoon YJ (2011) A combined approach of classical mutagenesis and rational metabolic engineering improves rapamycin biosynthesis and provides insights into methylmalonyl-CoA precursor supply pathway in Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253. Appl Microbiol Biotechnol 91(5):1389–1397
Jung WS, Kim E, Yoo YJ, Ban YH, Kim EJ, Yoon YJ (2014) Characterization and engineering of the ethylmalonyl-CoA pathway towards the improved heterologous production of polyketides in Streptomyces venezuelae. Appl Microbiol Biotechnol 98(8):3701–3713
Kieser T, Bibb MJ, Butter MJ, Chater KF, Hopwood DA (2000) Practical Streptomyces genetics: a laboratory manual. The John Innes Foundation, Norwich
Kosec G, Goranovic D, Mrak P, Fujs S, Kuscer E, Horvat J, Kopitar G, Petkovic H (2012) Novel chemobiosynthetic approach for exclusive production of FK506. Metab Eng 14(1):39–46
Li L, Wei K, Liu X, Wu Y, Zheng G, Chen S, Jiang W, Lu Y (2019) aMSGE: advanced multiplex site-specific genome engineering with orthogonal modular recombinases in Actinomycetes. Metab Eng 52:153–167
Lin J, Bai L, Deng Z, Zhong J (2011) Enhanced production of ansamitocin P-3 by addition of isobutanol in fermentation of Actinosynnema pretiosum. Bioresour Technol 102(2):1863–1868
Liu H, Reynolds KA (1999) Role of crotonyl coenzyme A reductase in determining the ratio of polyketides monensin A and monensin B produced by Streptomyces cinnamonensis. J Bacteriol 181(21):6806–6813
Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCt method. Methods 25(4):402–408
Lu C, Zhang X, Jiang M, Bai L (2016) Enhanced salinomycin production by adjusting the supply of polyketide extender units in Streptomyces albus. Metab Eng 35:129–137
Ochi K, Hosaka T (2013) New strategies for drug discovery: activation of silent or weakly expressed microbial gene clusters. Appl Microbiol Biotechnol 97(1):87–98
Qi H, Xin X, Li S, Wen J, Chen Y, Jia X (2012) Higher-level production of ascomycin (FK520) by Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus irradiated by femtosecond laser. Biotechnol Bioprocess Eng 17(4):770–779
Qi H, Zhao S, Fu H, Wen J, Jia X (2014a) Enhancement of ascomycin production in Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus by combining resin HP20 addition and metabolic profiling analysis. J Ind Microbiol Biotechnol 41(9):1365–1374
Qi H, Zhao S, Wen J, Chen Y, Jia X (2014b) Analysis of ascomycin production enhanced by shikimic acid resistance and addition in Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus. Biochem Eng J 82:124–133
Qi H, Lv M, Song K, Wen J (2017) Integration of parallel 13C-labeling experiments and in silico pathway analysis for enhanced production of ascomycin. Biotechnol Bioeng 114(5):1036–1044
Ryu Y, Butler MJ, Chater KF, Lee KJ (2006) Engineering of primary carbohydrate metabolism for increased production of actinorhodin in Streptomyces coelicolor. Appl Environ Microbiol 72(11):7132–7139
Song K, Wei L, Liu J, Wang J, Qi H, Wen J (2017) Engineering of the LysR family transcriptional regulator FkbR1 and its target gene to improve ascomycin production. Appl Microbiol Biotechnol 101(11):4581–4592
Wang Y, Zhang ZT, Seo SO, Lynn P, Lu T, Jin Y, Blaschek HM (2016) Gene transcription repression in Clostridium beijerinckii using CRISPR-dCas9. Biotechnol Bioeng 113(12):2739–2743
Wang C, Liu J, Liu H, Wang J, Wen J (2017a) A genome-scale dynamic flux balance analysis model of Streptomyces tsukubaensis NRRL18488 to predict the targets for increasing FK506 production. Biochem Eng J 123:45–56
Wang J, Wang C, Song K, Wen J (2017b) Metabolic network model guided engineering ethylmalonyl-CoA pathway to improve ascomycin production in Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus. Microb Cell Fact 16(1):169
Wei K, Wu Y, Li L, Jiang W, Hu J, Lu Y, Chen S (2018) MilR2, a novel TetR family regulator involved in 5-oxomilbemycin A3/A4 biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus. Appl Microbiol Biotechnol 102(20):8841–8853
Wu K, Chung L, Revill WP, Katz L, Reeves CD (2000) The FK520 gene cluster of Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (ATCC 14891) contains genes for biosynthesis of unusual polyketide extender units. Gene 251(1):81–90
Xia M, Huang D, Li S, Wen J, Jia X, Chen Y (2013) Enhanced FK506 production in Streptomyces tsukubaensis by rational feeding strategies based on comparative metabolic profiling analysis. Biotechnol Bioeng 110(10):2717–2730
Xie H, Zhao Q, Zhang X, Kang Q, Bai L (2019) Comparative functional genomics of the acarbose producers reveals potential targets for metabolic engineering. Synth Syst Biotechnol 4(1):49–56
Yu Z, Shen X, Wu Y, Yang S, Ju D, Chen S (2019) Enhancement of ascomycin production via a combination of atmospheric and room temperature plasma mutagenesis in Streptomyces hygroscopicus and medium optimization. AMB Express 9(1):25
Zhao Y, Li L, Zheng G, Jiang W, Deng Z, Wang Z, Lu Y (2018) CRISPR/dCas9-Mediated multiplex gene repression in Streptomyces. Biotechnol J 13(9):1800121