Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Phát triển chiến lược nhân bản và mở rộng tế bào đơn hiệu quả cho tế bào gốc sinh dưỡng đã chỉnh sửa gen
Tóm tắt
Các tế bào gốc sinh dưỡng người được cảm ứng (hiPSCs) đặc hiệu cho bệnh có thể được tạo ra trực tiếp từ những cá nhân có những đặc trưng bệnh lý đã biết, hoặc có thể được sửa đổi bằng các phương pháp chỉnh sửa gen để giới thiệu các đột biến gen gây bệnh nhằm nghiên cứu phản ứng sinh học của những đột biến đó. Quy trình chỉnh sửa gen trong hiPSCs vẫn chưa hiệu quả, đặc biệt là khi nói đến việc sửa chữa theo hướng đồng nhất (HDR) các đột biến gen hoặc chèn các gen mục tiêu vào bộ gen và nhân bản tế bào đơn của các tế bào đã chỉnh sửa. Hơn nữa, quy trình chỉnh sửa gen cũng liên quan đến những căng thẳng tế bào bổ sung như khả năng sống của tế bào kém và tính ổn định gen của hiPSCs. Do đó, cần có các quy trình làm việc hiệu quả để tăng cường ứng dụng chỉnh sửa gen vào các mô hình bệnh hiPSC và các ứng dụng trị liệu. Để đạt được điều này, chúng tôi đã chứng minh một quy trình làm việc hiệu quả để tạo ra và mở rộng các clone tế bào đơn trong cả dòng hiPSC bị knock-out (KO) và knock-in (KI) do CRISPR. Sử dụng môi trường StemFlex và phụ gia CloneR kết hợp với ma trận nuôi cấy tế bào Matrigel, chúng tôi cho thấy khả năng sống và mở rộng tế bào trong quá trình nhân bản tế bào đơn ở các tế bào đã chỉnh sửa và chưa chỉnh sửa được cải thiện đáng kể. Xem xét tất cả các yếu tố, chúng tôi đã thành công trong việc đạt được tỷ lệ sống sót và nhân bản tế bào đơn hiPSC trong cả tế bào đã chỉnh sửa và chưa chỉnh sửa lên tới 70% trong chưa đầy 2 tuần. Quy trình làm việc đơn giản và hiệu quả này sẽ cho phép một cấp độ tinh vi mới trong việc tạo ra các mô hình bệnh dựa trên hiPSC nhằm thúc đẩy sự phát triển nhanh chóng trong nghiên cứu cơ bản và cũng như sự phát triển của các liệu pháp tế bào mới.
Từ khóa
Tài liệu tham khảo
Rowe R, Daley G (2019) Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Genet 20(7):377–388. https://doi.org/10.1038/s41576-019-0100-z
Liu G, David B, Trawczynski M, Fessler R (2019) Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Rev Rep 16(1):3–32. https://doi.org/10.1007/s12015-019-09935-x
Govindan G, Ramalingam S (2016) Programmable site-specific nucleases for targeted genome engineering in higher eukaryotes. J Cell Physiol 231(11):2380–2392. https://doi.org/10.1002/jcp.25367
Kawatani K, Nambara T, Nawa N, Yoshimatsu H, Kusakabe H, Hirata K et al (2021) A human isogenic iPSC-derived cell line panel identifies major regulators of aberrant astrocyte proliferation in Down syndrome. Commun Biol. https://doi.org/10.1038/s42003-021-02242-7
Dakhore S, Nayer B, Hasegawa K (2018) Human pluripotent stem cell culture: current status, challenges, and advancement. Stem Cells International 2018:1–17. https://doi.org/10.1155/2018/7396905
Buzzard J, Gough N, Crook J, Colman A (2004) Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat Biotechnol 22(4):381–382. https://doi.org/10.1038/nbt0404-381
DeWeirdt P, Sangree A, Hanna R, Sanson K, Hegde M, Strand C et al (2020) Genetic screens in isogenic mammalian cell lines without single cell cloning. Nat Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14620-6
Singh A (2019) An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. https://doi.org/10.3389/fcell.2019.00011
Chen Y, Pruett-Miller S (2018) Improving single-cell cloning workflow for gene editing in human pluripotent stem cells. Stem Cell Res 31:186–192. https://doi.org/10.1016/j.scr.2018.08.003
Bhargava N, Jaitly S, Goswami S, Jain S, Chakraborty D, Ramalingam S (2019) Generation and characterization of induced pluripotent stem cell line (IGIBi001-A) from a sickle cell anemia patient with homozygous β-globin mutation. Stem Cell Research 39:101484. https://doi.org/10.1016/j.scr.2019.101484
Thakur P, Bhargava N, Jaitly S, Gupta P, Kumar Bhattacharya S, Padma G et al (2021) Establishment and characterization of induced pluripotent stem cell line (IGIBi002-A) from a β-thalassemia patient with IVS1-5 mutation by non-integrating reprogramming approach. Stem Cell Res 50:102124. https://doi.org/10.1016/j.scr.2020.102124
Adli M (2018) The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-018-04252-2
Amit M, Carpenter M, Inokuma M, Chiu C, Harris C, Waknitz M et al (2000) Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev Biol 227(2):271–278. https://doi.org/10.1006/dbio.2000.9912
Valamehr B, Abujarour R, Robinson M, Le T, Robbins D, Shoemaker D, Flynn P (2012) A novel platform to enable the high-throughput derivation and characterization of feeder-free human iPSCs. Sci Rep 2:213. https://doi.org/10.1038/srep00213
Vazin T, Freed W (2010) Human embryonic stem cells: derivation, culture, and differentiation: a review. Restor Neurol Neurosci 28(4):589–603. https://doi.org/10.3233/rnn-2010-0543
Bajpai R, Lesperance J, Kim M, Terskikh A (2008) Efficient propagation of single cells accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev 75(5):818–827. https://doi.org/10.1002/mrd.20809
Currall B, Chiangmai C, Talkowski M, Morton C (2013) Mechanisms for structural variation in the human genome. Curr Genet Med Rep 1(2):81–90. https://doi.org/10.1007/s40142-013-0012-8
Yang H, Ren S, Yu S, Pan H, Li T, Ge S et al (2020) Methods favoring homology-directed repair choice in response to CRISPR/Cas9 induced-double strand breaks. Int J Mol Sci 21(18):6461. https://doi.org/10.3390/ijms21186461
Chen K, Mallon B, McKay R, Robey P (2014) Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell 14(1):13–26. https://doi.org/10.1016/j.stem.2013.12.005
Niccheri F, Pecori R, Conticello S (2017) An efficient method to enrich for knock-out and knock-in cellular clones using the CRISPR/Cas9 system. Cell Mol Life Sci 74(18):3413–3423. https://doi.org/10.1007/s00018-017-2524-y