Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Phát triển phương pháp PCR thời gian thực đa liều trong một ống để phát hiện và xác định năm mục tiêu bệnh lý bằng cách sử dụng phân tích đường nóng chảy với EvaGreen
Tóm tắt
SYBR Green I (SG) được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng PCR thời gian thực như một thuốc nhuộm intercalating. Sự gắn kết ưu thế của SG trong quá trình PCR và sự ức chế PCR thường dẫn đến việc không phát hiện được nhiều amplicons trong các phản ứng đa liều. Trong nghiên cứu hiện tại, một thử nghiệm PCR thời gian thực đa liều trong một ống mới với thuốc nhuộm EvaGreen (EG) đã được phát triển và đánh giá để phát hiện đồng thời các mục tiêu bệnh lý bằng cách sử dụng năm vi rút khoai tây làm mô hình. Các sản phẩm PCR thu được từ năm bộ mồi đặc hiệu đã được phân tích bằng phân tích đường nóng chảy. Phương pháp có thể phát hiện và phân biệt một cách cụ thể năm vi rút khoai tây bằng cách tạo ra một đỉnh đặc trưng cho mỗi sản phẩm khuếch đại và cho thấy tính tái lập cao với các hệ số biến thiên từ 0,01 đến 0,25%. Độ nhạy phát hiện của phương pháp dao động từ 100 đến 500 bản sao/μL cho mỗi vi rút. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng PCR thời gian thực đa liều và phân tích đường nóng chảy với EG là một phương pháp nhạy cảm, đặc hiệu và chi phí thấp cho việc phát hiện đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh.
Từ khóa
#PCR thời gian thực #EvaGreen #vi rút khoai tây #phát hiện đồng thời #phân tích đường nóng chảyTài liệu tham khảo
Agindotan BO, Shiel PJ, Berger PH (2007) Simultaneous detection of potato viruses, PLRV, PVA, PVX and PVY from dormant potato tubers by TaqMan real-time RT-PCR. J Virol Methods 142:1–9
Armani A, Castigliego L, Tinacci L, Gianfaldoni D, Guidi A (2012) Multiplex conventional and real-time PCR for fish species identification of Bianchetto (juvenile form of Sardina pilchardus), Rossetto (Aphia minuta), and Icefish in fresh, marinated and cooked products. Food Chem 133:184–192
Boonham N, Walsh K, Mumford RA, Barker I (2000) Use of multiplex real-time PCR (TaqMan) for the detection of potato viruses. EPPO Bull 30:427–430
Brownie J, Shawcross S, Theaker J, Whitcombe D, Ferrie R, Newton C, Little S (1997) The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res 25:3235–3241
Bustin SA (2000) Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol 25:169–193
Bustin SA (2002) Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol 29:23–39
Chassagne L, Pradel N, Robin F, Livrelli V, Bonnet R, Delmas J (2009) Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction. Diagn Microbiol Infect Dis 64:98–101
Du ZY, Chen JS, Hiruki C (2006) Optimization and application of a multiplex RT-PCR System for simultaneous detection of five potato viruses using 18S rRNA as an internal control. Plant Dis 90:185–189
Elizaquivel P, Aznar R (2008) A multiplex RTi-PCR reaction for simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp. and Staphylococcus aureus on fresh, minimally processed vegetables. Food Microbiol 25:705–713
Giglio S, Monis PT, Saint CP (2003) Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res 31:e136
Guion CE, Ochoa TJ, Walker CM, Barletta F, Cleary TG (2008) Detection of diarrheagenic Escherichia coli by use of melting-curve analysis and real-time multiplex PCR. J Clin Microbiol 46:1752–1757
Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM (1996) Real time quantitative PCR. Genome Res 6:986–994
Socorro Hernandez-Arteaga, Rubén L-R (2008) Quantitation of human papilloma virus type 16 E6 oncogene sequences by real-time or quantitative PCR with EvaGreen. Anal Biochem 380:131–133
Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, Griffith R (1992) Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Bio/Technology 10:413–417
Khan SA, Sung K, Nawaz MS (2011) Detection of aacA-aphD, qacEdelta1, marA, floR, and tetA genes from multidrug-resistant bacteria: Comparative analysis of real-time multiplex PCR assays using EvaGreen® and SYBR® Green I dyes. Mol Cell Probes 25:78–86
Li YD, Chu ZZ, Liu XG, Jing HC, Liu YG, Hao DY (2010) A cost-effective high-resolution melting approach using the EvaGreen dye for DNA polymorphism detection and genotyping in plants. J Integr Plant Biol 52:1036–1042
Lipsky RH, Mazzanti CM, Rudolph JG, Xu K, Vyas G, Bozak D, Radel MQ, Goldman D (2001) DNA melting analysis for detection of single nucleotide polymorphisms. Clin Chem 47:635–644
Mao F, Leung WY, Xin X (2007) Characterization of EvaGreen and the implication of its physicochemical properties for qPCR applications. BMC Biotechnol 7:76
Mendes RE, Kiyota KA, Monteiro J, Castanheira M, Andrade SS, Gales AC, Pignatari AC, Tufik S (2007) Rapid detection and identification of metallo-beta-lactamase-encoding genes by multiplex real-time PCR assay and melt curve analysis. J Clin Microbiol 45:544–547
Monis PT, Giglio S, Saint CP (2005) Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for real-time polymerase chain reaction and investigation of the effect of dye concentration on amplification and DNA melting curve analysis. Anal Biochem 340:24–34
Mortimer-Jones SM, Jones MG, Jones RA, Thomson G, Dwyer GI (2009) A single tube, quantitative real-time RT-PCR assay that detects four potato viruses simultaneously. J Virol Methods 161:289–296
Papin JF, Vahrson W, Dittmer DP (2004) SYBR green-based real-time quantitative PCR assay for detection of West Nile Virus circumvents false-negative results due to strain variability. J Clin Microbiol 42:1511–1518
Perez LJ, Perera CL, Frias MT, Nunez JI, Ganges L, de Arce HD (2012) A multiple SYBR Green I-based real-time PCR system for the simultaneous detection of porcine circovirus type 2, porcine parvovirus, pseudorabies virus and Torque teno sus virus 1 and 2 in pigs. J Virol Methods 179:233–241
Pietila J, He Q, Oksi J, Viljanen MK (2000) Rapid differentiation of Borrelia garinii from Borrelia afzelii and Borrelia burgdorferi sensu stricto by LightCycler fluorescence melting curve analysis of a PCR product of the recA gene. J Clin Microbiol 38:2756–2759
Polz MF, Cavanaugh CM (1998) Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR. Appl Environ Microbiol 64:3724–3730
Ririe KM, Rasmussen RP, Wittwer CT (1997) Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal Biochem 245:154–160
Tanriverdi S, Tanyeli A, Baslamisli F, Koksal F, Kilinc Y, Feng X, Batzer G, Tzipori S, Widmer G (2002) Detection and genotyping of oocysts of Cryptosporidium parvum by real-time PCR and melting curve analysis. J Clin Microbiol 40:3237–3244
Vandesompele J, De Paepe A, Speleman F (2002) Elimination of primer-dimer artifacts and genomic coamplification using a two-step SYBR green I real-time RT-PCR. Anal Biochem 303:95–98
Varga A, James D (2006) Real-time RT-PCR and SYBR Green I melting curve analysis for the identification of Plum pox virus strains C, EA, and W: effect of amplicon size, melt rate, and dye translocation. J Virol Methods 132:146–153