Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Sản xuất tế bào gốc phôi chuột cống và tạo ra chuột knockout thụ thể được kích hoạt bởi protease-2
Tóm tắt
Một trong những thành tựu nổi bật trong việc sản xuất chuột knockout (KO) được báo cáo trong giai đoạn 2008–2010 là việc chiết xuất tế bào gốc phôi (ES) thực sự từ phôi chuột cống sử dụng môi trường nuôi cấy mới chứa các chất ức chế glycogen synthase kinase 3 và các chất ức chế kinase được kích hoạt bởi mitogen (môi trường 2i). Ở đây, chúng tôi báo cáo công nghệ nhắm gen thông qua tái tổ hợp đồng hợp ở tế bào ES chuột cống, chứng minh tính khả thi của nó thông qua việc tạo ra chuột KO thụ thể kích hoạt bởi protease-2 (Par-2). Chúng tôi bắt đầu từ việc tạo ra các tế bào ES đủ năng lực dòng germline từ chuột Dark Agouti sử dụng môi trường 2i. Các tế bào ES này, có khả năng biệt hóa thành tế bào cơ tim in vitro, có thể sản xuất ra các chimeras với tỷ lệ đóng góp tế bào ES cao khi được tiêm vào phôi. Chúng tôi sau đó đã giới thiệu một vector nhắm mục tiêu với gen kháng neomycin được điều khiển bởi promoter CAG nhằm làm gián đoạn gen Par-2. Sau 7 ngày chọn lọc thuốc, 489 tế bào thuộc địa kháng neomycin đã được thu được. Sau khi sàng lọc bằng phân tích genotyping PCR và PCR định lượng, chúng tôi xác nhận được ba dòng tái tổ hợp đồng hợp, dẫn đến các chimeras đã truyền được loại allele nhắm mục tiêu Par-2 cho các thế hệ sau. Chuột Par-2 KO cho thấy sự mất biểu hiện mRNA Par-2 trong các tế bào dạ dày và thiếu sự thư giãn cơ trơn trung gian PAR-2 trong động mạch chủ như được chỉ ra bởi các xét nghiệm dược lý. So với chuột, chuột cống mang lại nhiều lợi thế trong nghiên cứu sinh học y khoa, bao gồm kích thước cơ thể lớn hơn; do đó, chúng được sử dụng rộng rãi trong các điều tra khoa học. Do đó, việc thiết lập công nghệ nhắm gen sử dụng tế bào ES chuột cống sẽ là một công cụ quý giá trong việc tạo ra mô hình bệnh lý ở người cũng như trong phát hiện thuốc.
Từ khóa
#tế bào gốc phôi #chuột knockout #thụ thể kích hoạt bởi protease-2 #tái tổ hợp đồng hợp #nghiên cứu sinh học y khoaTài liệu tham khảo
Buehr M, Meek S, Blair K, Yang J, Ure J, Silva J, McLay R, Hall J, Ying QL, Smith A (2008) Capture of authentic embryonic stem cells from rat blastocysts. Cell 135:1287–1298
Capecchi MR (2005) Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet 6:507–512
Cocks TM, Fong B, Chow JM, Anderson GP, Frauman AG, Goldie RG, Henry PJ, Carr MJ, Hamilton JR, Moffatt JD (1999) A protective role for protease-activated receptors in the airways. Nature 398:156–160
Consortium International Mouse Knockout, Collins FS, Rossant J, Wurst W (2007) A mouse for all reasons. Cell 128:9–13
Consortium STAR, Saar K, Beck A, Bihoreau MT, Birney E, Brocklebank D, Chen Y, Cuppen E, Demonchy S, Dopazo J, Flicek P, Foglio M, Fujiyama A, Gut IG, Gauguier D, Guigo R, Guryev V, Heinig M, Hummel O, Jahn N, Klages S, Kren V, Kube M, Kuhl H, Kuramoto T, Kuroki Y, Lechner D, Lee YA, Lopez-Bigas N, Lathrop GM, Mashimo T, Medina I, Mott R, Patone G, Perrier-Cornet JA, Platzer M, Pravenec M, Reinhardt R, Sakaki Y, Schilhabel M, Schulz H, Serikawa T, Shikhagaie M, Tatsumoto S, Taudien S, Toyoda A, Voigt B, Zelenika D, Zimdahl H, Hubner N (2008) SNP and haplotype mapping for genetic analysis in the rat. Nat Genet 40:560–566
Cui X, Ji D, Fisher DA, Wu Y, Briner DM, Weinstein EJ (2011) Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol 29:64–67
Damiano BP, Cheung WM, Santulli RJ, Fung-Leung WP, Ngo K, Ye RD, Darrow AL, Derian CK, de Garavilla L, Andrade-Gordon P (1999) Cardiovascular responses mediated by protease-activated receptor-2 (PAR-2) and thrombin receptor (PAR-1) are distinguished in mice deficient in PAR-2 or PAR-1. J Pharmacol Exp Ther 288:671–678
Evans MJ, Kaufman MH (1981) Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292:154–156
Feero WG, Guttmacher AE, Collins FS (2010) Genomic medicine—an updated primer. N Engl J Med 362:2001–2011
Geurts AM, Cost GJ, Freyvert Y, Zeitler B, Miller JC, Choi VM, Jenkins SS, Wood A, Cui X, Meng X, Vincent A, Lam S, Michalkiewicz M, Schilling R, Foeckler J, Kalloway S, Weiler H, Ménoret S, Anegon I, Davis GD, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD, Jacob HJ, Buelow R (2009) Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science 325:433
Hirabayashi M, Kato M, Kobayashi T, Sanbo M, Yagi T, Hochi S, Nakauchi H (2010) Establishment of rat embryonic stem cell lines that can participate in germline chimerae at high efficiency. Mol Reprod Dev 77:94
Hockemeyer D, Soldner F, Beard C, Gao Q, Mitalipova M, DeKelver RC, Katibah GE, Amora R, Boydston EA, Zeitler B, Meng X, Miller JC, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD, Jaenisch R (2009) Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol 27:851–857
Izsvák Z, Fröhlich J, Grabundzija I, Shirley JR, Powell HM, Chapman KM, Ivics Z, Hamra FK (2010) Generating knockout rats by transposon mutagenesis in spermatogonial stem cells. Nat Methods 7:443–445
Jacob HJ, Lazar J, Dwinell MR, Moreno C, Geurts AM (2010) Gene targeting in the rat: advances and opportunities. Trends Genet 26:510–518
Katada H, Chen HJ, Shigi N, Komiyama M (2009) Homologous recombination in human cells using artificial restriction DNA cutter. Chem Commun (Camb) (43):6545–6547
Kawabata A (2003) Gastrointestinal functions of proteinase-activated receptors. Life Sci 74:247–254
Kawabata A, Kubo S, Nakaya Y, Ishiki T, Kuroda R, Sekiguchi F, Kawao N, Nishikawa H (2004) Distinct roles for protease-activated receptors 1 and 2 in vasomotor modulation in rat superior mesenteric artery. Cardiovasc Res 61:683–692
Kawagoe J, Takizawa T, Matsumoto J, Tamiya M, Meek SE, Smith AJ, Hunter GD, Plevin R, Saito N, Kanke T, Fujii M, Wada Y (2002) Effect of protease-activated receptor-2 deficiency on allergic dermatitis in the mouse ear. Jpn J Pharmacol 88:77–84
Kawamata M, Ochiya T (2010) Generation of genetically modified rats from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 107:14223–14228
Kitada K, Ishishita S, Tosaka K, Takahashi R, Ueda M, Keng VW, Horie K, Takeda J (2007) Transposon-tagged mutagenesis in the rat. Nat Methods 4:131–133
Li P, Tong C, Mehrian-Shai R, Jia L, Wu N, Yan Y, Maxson RE, Schulze EN, Song H, Hsieh CL, Pera MF, Ying QL (2008) Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts. Cell 135:1299–1310
Lindner JR, Kahn ML, Coughlin SR, Sambrano GR, Schauble E, Bernstein D, Foy D, Hafezi-Moghadam A, Ley K (2000) Delayed onset of inflammation in protease-activated receptor-2-deficient mice. J Immunol 165:6504–6510
Martin GR (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 78:7634–7638
McNeish J (2004) Embryonic stem cells in drug discovery. Nat Rev Drug Discov 3:70–80
Nagy A, Gócza E, Diaz EM, Prideaux VR, Iványi E, Markkula M, Rossant J (1990) Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse. Development. 110:815–821
Nichols J, Ying QL (2006) Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol 329:91–98
Shinozawa T, Tsuji A, Imahashi K, Nakashima K, Sawada H, Toyoshiba H, Yamamoto S, Takami K, Imai R (2009) Gene expression profiling of functional murine embryonic stem cell-derived cardiomyocytes and comparison with adult heart: profiling of murine ESC-derived cardiomyocytes. J Biomol Screen 14:239–245
Tong C, Li P, Wu NL, Yan Y, Ying QL (2010) Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature 467:211–213
Valenzuela DM, Murphy AJ, Frendewey D, Gale NW, Economides AN, Auerbach W, Poueymirou WT, Adams NC, Rojas J, Yasenchak J, Chernomorsky R, Boucher M, Elsasser AL, Esau L, Zheng J, Griffiths JA, Wang X, Su H, Xue Y, Dominguez MG, Noguera I, Torres R, Macdonald LE, Stewart AF, DeChiara TM, Yancopoulos GD (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21:652–659
Ying QL, Smith AG (2003) Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol 365:327–341
Ying QL, Wray J, Nichols J, Batlle-Morera L, Doble B, Woodgett J, Cohen P, Smith A (2008) The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature 453:519–523
Zambrowicz BP, Sands AT (2003) Knockouts model the 100 best-selling drugs—will they model the next 100? Nat Rev Drug Discov 2:38–51
Zan Y, Haag JD, Chen KS, Shepel LA, Wigington D, Wang YR, Hu R, Lopez-Guajardo CC, Brose HL, Porter KI, Leonard RA, Hitt AA, Schommer SL, Elegbede AF, Gould MN (2003) Production of knockout rats using ENU mutagenesis and a yeast-based screening assay. Nat Biotechnol 21:645–651
Zhou Q, Renard JP, Le Friec G, Brochard V, Beaujean N, Cherifi Y, Fraichard A, Cozzi J (2003) Generation of fertile cloned rats by regulating oocyte activation. Science 302:1179