Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Phương Pháp Phát Hiện Đột Biến Gen Thụ Thể Vitamin D Bằng Phương Pháp ELISA PCR-RFLP Sinh Huỳnh Quang
Tóm tắt
Chúng tôi đã phát triển một phương pháp PCR-RFLP ELISA nhạy cảm và nhanh chóng sử dụng kinase acetate (AK) và luciferase đom đóm làm hệ thống phát hiện. AK được sử dụng như một enzym đánh dấu có thể được phát hiện nhạy cảm qua thử nghiệm sinh huỳnh quang dựa trên phản ứng của luciferase đom đóm. Giới hạn phát hiện là 10–20 mol/thí nghiệm và độ phát quang ổn định trong 48 giờ. Mồi cảm ứng gắn FITC và mồi phản cảm gắn biotin được sử dụng để khuếch đại gen thụ thể vitamin D. Sau khi PCR, các sản phẩm được phân hủy bằng enzym Taq I hoặc Apa I. Các sản phẩm phản ứng được pha loãng bằng đệm thí nghiệm và chuyển vào đĩa được phủ với anti FITC IgG. Sau 2 giờ ủ ở 37˚C, đĩa được rửa và phản ứng với avidin/AK gắn biotin, hoạt động của AK được phát hiện qua thử nghiệm sinh huỳnh quang sử dụng hệ thống luciferin/luciferase đom đóm. Các kiểu biến thể DNA (AA, Aa, aa, TT, Tt, tt) của gen thụ thể vitamin D (VDR) có thể được xác định rõ ràng bằng cách đo cường độ sinh huỳnh quang hoặc bằng cách sử dụng hình ảnh photon với camera CCD.
Từ khóa
#PCR-RFLP #vitamin D receptor gene #bioluminescence #enzyme-linked immunosorbent assay #kinases.Tài liệu tham khảo
N. A. Morrison, R. Yeoman, P. J. Kelly and J. A. Eisman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 6665 (1992).
N. A. Morrison, J. C. Qi, A. Tokita, P. J. Kelly, L. Crofts, T. V. Nguen, P. N. Sambrook and J. A. Eisman, Nature[London], 367, 284 (1994).
A. Tokita, H. Matsumoto and N. A. Morrison, J. Bone Miner. Res., 11, 1003 (1996).
H. Arai, K. Miyamoto, Y. Taketani, H. Yamamoto, Y. Iemori, K. Morita, T. Tonai, T. Nishisho, S. Mori and E. Takeda, J. Bone Miner. Res., 12, 915 (1997).
M. Hahn, V. Dorsam, P. Friedhoff, A. Fritz and A. Pingoud, Anal. Biochem., 229, 236 (1995).
L. Xiao, C. Yang, C. O. Nelson, B. P. Holloway, V. Udhayakumar and A. A. Lal, J. Immunol. Method, 199, 139 (1996).
K. Tominaga, Y. Miura, T. Arakawa, K. Kobayashi and M. Mitsuhashi, Clin. Chem., 42, 1750 (1996).
I. Bronstein, B. Edwards and C. Voyta, J. Biolumin. Chemilumin., 4, 99 (1989).
W. Miska and R. Geiger, J. Biolumin. Chemilumn., 4, 119 (1989).
H. Arakawa, M. Maeda and A. Tsuji, Anal. Lett., 25, 1055 (1992).
M. Maeda, A. Tsuji and S. Murakami, Anal. Lett., 28, 383 (1995).
S. Murakami, M. Nakajima, H. Sekine, M. Maeda and A. Tsuji, Anal. Lett., 29, 969 (1996).
J. A. Eisman, J. Bone Miner. Res., 10, 1289 (1995).
M. Peacock, J. Bone Miner. Res., 10, 1294 (1995).
G. S. Cooper and D. M. Umbach, J. Bone Miner. Res., 11, 1841 (1996).
E. M. Greenfield and V. M. Goldberg, Lancet, 350, 1263 (1997).
H. Arakawa, M. Maeda and A. Tsuji, Anal. Biochem., 199, 238 (1991).
H. Arakawa, T. Ikegami, M. Maeda and A. Tsuji, J. Biolumin. Chemilumn., 8, 135 (1993).