Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Một phương pháp chuyển giao gen hiệu quả bằng Agrobacterium cho nấm sinh aflatoxin Aspergillus flavus
Tóm tắt
Aspergillus flavus thường xâm nhập vào nhiều loại cây trồng quan trọng và sản xuất aflatoxin độc hại cả ở giai đoạn thu hoạch và trong quá trình bảo quản. Cơ chế điều chỉnh quá trình tổng hợp aflatoxin trong nấm này vẫn chưa được khám phá rõ ràng chủ yếu do thiếu phương pháp chuyển giao gen hiệu quả để xây dựng thư viện đột biến gen trên toàn bộ genome. Thách thức này đã được giải quyết trong nghiên cứu này, nơi một giao thức chuyển giao gen bằng Agrobacterium tumefaciens (ATMT) đáng tin cậy và hiệu quả cho A. flavus NRRL 3357 đã được thiết lập. Kết quả cho thấy việc loại bỏ conidia đa nhân để thu thập một mẫu đồng nhất của conidia đơn nhân để sử dụng làm vật liệu chuyển giao là bước then chốt trong quy trình này. Chủng A. tumefaciens AGL-1 mang gen ble chống lại zeocin dưới sự kiểm soát của promoter gpdA từ A. nidulans là phù hợp cho việc chuyển giao gen của nấm này. Chúng tôi đã thành công trong việc tạo ra các biến thể A. flavus với hiệu suất khoảng 60 biến thể dương tính trên 106 conidia bằng cách sử dụng giao thức của chúng tôi. Một thư viện đột biến chèn quy mô nhỏ (~ 1.000 đột biến) đã được xây dựng bằng phương pháp này và vài đột biến thu được không sản xuất được conidia và cũng không có khả năng tổng hợp aflatoxin. Phân tích Southern blotting đã chứng minh rằng hầu hết các biến thể chứa một chèn T-DNA đơn trên genome. Theo những gì chúng tôi biết, đây là báo cáo đầu tiên về việc chuyển giao gen của A. flavus thông qua ATMT và giao thức của chúng tôi cung cấp một công cụ hiệu quả cho việc xây dựng thư viện đột biến gen trên toàn bộ genome để phân tích chức năng của các gen quan trọng trong A. flavus.
Từ khóa
#Aspergillus flavus #aflatoxin #chuyển giao gen #Agrobacterium tumefaciens #thư viện đột biến genTài liệu tham khảo
Affeldt, K.J., Brodhagen, M., and Keller, N.P. 2012. Aspergillus oxylipin signaling and quorum sensing pathways depend on G protein-coupled receptors. Toxins 4, 695–717.
Affeldt, K.J., Carrig, J., Amare, M., and Keller, N.P. 2014. Global survey of canonical Aspergillus flavus G protein-coupled receptors. mBio 5, e01501–14.
Allen, G.C., Flores-Vergara, M.A., Krasnyanski, S., Kumar, S., and Thompson, W.F. 2006. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethylammonium bromide. Nat. Protoc. 1, 2320–2325.
Baird, G.S., Zacharias, D.A., and Tsien, R.Y. 2000. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 11984–11989.
Bhatnagar, D., Ehrlich, K.C., and Cleveland, T.E. 2003. Molecular genetic analysis and regulation of aflatoxin biosynthesis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 61, 83–93.
Chen, X.L., Yang, J., and Peng, Y.L. 2011. Large-scale insertional mutagenesis in Magnaporthe oryzae by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Methods Mol. Biol. 722, 213–224.
Colot, H.V., Park, G., Turner, G.E., Ringelberg, C., Crew, C.M., Litvinkova, L., Weiss, R.L., Borkovich, K.A., and Dunlap, J.C. 2006. A high-throughput gene knockout procedure for neurospora reveals functions for multiple transcription factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 10352–10357.
Crespo-Sempere, A., Lopez-Perez, M., Martinez-Culebras, P.V., and Gonzalez-Candelas, L. 2011. Development of a green fluorescent tagged strain of Aspergillus carbonarius to monitor fungal colonization in grapes. Int. J. Food Microbiol. 148, 135–140.
de Groot, M.J., Bundock, P., Hooykaas, P.J., and Beijersbergen, A.G. 1998. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nat. Biotechnol. 16, 839–842.
Foudin, L.L., Papa, K.E., and Hanlin, R.T. 1981. Nuclear behavior during conidiogenesis in Aspergillus flavus. Canadian J. Bot. 59, 2116–2120.
Gouka, R.J., Gerk, C., Hooykaas, P.J., Bundock, P., Musters, W., Verrips, C.T., and de Groot, M.J. 1999. Transformation of Aspergillus awamori by Agrobacterium tumefaciens-mediated homologous recombination. Nat. Biotechnol. 17, 598–601.
Hamer, J.E. and Timberlake, W.E. 1987. Functional organization of the Aspergillus nidulans trpC promoter. Mol. Cell. Biol. 7, 2352–2359.
He, Z.M., Price, M.S., OBrian, G.R., Georgianna, D.R., and Payne, G.A. 2007. Improved protocols for functional analysis in the pathogenic fungus Aspergillus flavus. BMC Microbiol. 7, 104.
Jeon, J., Park, S.Y., Chi, M.H., Choi, J., Park, J., Rho, H.S., Kim, S., Goh, J., Yoo, S., Choi, J., et al. 2007. Genome-wide functional analysis of pathogenicity genes in the rice blast fungus. Nat. Genet. 39, 561–565.
Kalleda, N., Naorem, A., and Manchikatla, R.V. 2013. Targeting fungal genes by diced siRNAs: A rapid tool to decipher gene function in Aspergillus nidulans. PLoS One 8, e75443.
Klich, M.A. 2007. Aspergillus flavus: The major producer of aflatoxin. Mol. Plant Pathol. 8, 713–722.
Leclerque, A., Wan, H., Abschutz, A., Chen, S., Mitina, G.V., Zimmermann, G., and Schairer, H.U. 2004. Agrobacterium-mediated insertional mutagenesis (aim) of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. Curr. Genet. 45, 111–119.
Li, G.H., Zhou, Z.Z., Liu, G.F., Zheng, F.C., and He, C.Z. 2007. Characterization of t-DNA insertion patterns in the genome of rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Curr. Genet. 51, 233–243.
Liu, N., Chen, G.Q., Ning, G.A., Shi, H.B., Zhang, C.L., Lu, J.P., Mao, L.J., Feng, X.X., Liu, X.H., Su, Z.Z., et al. 2016. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation: An efficient tool for insertional mutagenesis and targeted gene disruption in Harpophora oryzae. Microbiol. Res. 182, 40–48.
Lohmar, J.M., Harris-Coward, P.Y., Cary, J.W., Dhingra, S., and Calvo, A.M. 2016. rTFA, a putative RNA-Pol II transcription elongation factor gene, is necessary for normal morphological and chemical development in Aspergillus flavus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 100, 5029–5041.
Lv, Y. 2017. Proteome-wide profiling of protein lysine acetylation in Aspergillus flavus. PLoS One 12, e0178603.
Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. 1982. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.
Michielse, C.B., Hooykaas, P.J.J., van den Hondel, C.A.M.J.J., and Ram, A.F.J. 2005. Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi. Curr. Genet. 48, 1–17.
Michielse, C.B., Hooykaas, P.J., van den Hondel, C.A., and Ram, A.F. 2008. Agrobacterium-mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus awamori. Nat. Protoc. 3, 1671–1678.
Michielse, C.B., Ram, A.F.J., Hooykaas, P.J.J., and van den Hondel, C.A.M.J.J. 2004. Role of bacterial virulence proteins in Agrobacterium-mediated transformation of Aspergillus awamori. Fungal Genet. Biol. 41, 571–578.
Mitchell, N.J., Bowers, E., Hurburgh, C., and Wu, F. 2016. Potential economic losses to the US corn industry from aflatoxin contamination. Food Addit. Contam. A. 33, 540–550.
Mora-Lugo, R., Zimmermann, J., Rizk, A.M., and Fernandez-Lahore, M. 2014. Development of a transformation system for Aspergillus sojae based on the Agrobacterium tumefaciens-mediated approach. BMC Microbiol. 14, 247.
Mullins, E.D., Chen, X., Romaine, P., Raina, R., Geiser, D.M., and Kang, S. 2001. Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum: An efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer. Phytopathology 91, 173–180.
Nierman, W.C., Yu, J., Fedorova-Abrams, N.D., Losada, L., Cleveland, T.E., Bhatnagar, D., Bennett, J.W., Dean, R., and Payne, G.A. 2015. Genome sequence of Aspergillus flavus NRRL 3357, a strain that causes aflatoxin contamination of food and feed. Genome Announc. 3, e00168–15.
Punt, P.J., Zegers, N.D., Busscher, M., Pouwels, P.H., and van den Hondel, C.A. 1991. Intracellular and extracellular production of proteins in Aspergillus under the control of expression signals of the highly expressed Aspergillus nidulans gpdA gene. J. Biotechnol. 17, 19–33.
Rho, H.S., Kang, S., and Lee, Y.H. 2001. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of the plant pathogenic fungus, Magnaporthe grisea. Mol. Cells 12, 407–411.
Runa, F., Carbone, I., Bhatnagar, D., and Payne, G.A. 2015. Nuclear heterogeneity in conidial populations of Aspergillus flavus. Fungal Genet. Biol. 84, 62–72.
Schmidt-Heydt, M., Abdel-Hadi, A., Magan, N., and Geisen, R. 2009. Complex regulation of the aflatoxin biosynthesis gene cluster of Aspergillus flavus in relation to various combinations of water activity and temperature. Int. J. Food Microbiol. 135, 231–237.
Sorensen, L.Q., Lysoe, E., Larsen, J.E., Khorsand-Jamal, P., Nielsen, K.F., and Frandsen, R.J. 2014. Genetic transformation of Fusarium avenaceum by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation and the development of a user-brick vector construction system. BMC Mol. Biol. 15, 15.
Sugui, J.A., Chang, Y.C., and Kwon-Chung, K.J. 2005. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Aspergillus fumigatus: An efficient tool for insertional mutagenesis and targeted gene disruption. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1798–1802.
Wang, D.Y., He, D., Li, G.Q., Gao, S., Lv, H.Y., Shan, Q.S., and Wang, L. 2014. An efficient tool for random insertional mutagenesis: Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus terreus. J. Microbiol. Methods 98, 114–118.
Woloshuk, C.P., Seip, E.R., Payne, G.A., and Adkins, C.R. 1989. Genetic transformation system for the aflatoxin-producing fungus Aspergillus flavus. Appl. Environ. Microbiol. 55, 86–90.
Yang, K.L., Liang, L.L., Ran, F.L., Liu, Y.H., Li, Z.G., Lan, H.H., Gao, P.L., Zhuang, Z.H., Zhang, F., Nie, X.Y., et al. 2016. The DmtA methyltransferase contributes to Aspergillus flavus conidiation, sclerotial production, aflatoxin biosynthesis and viru lence. Sci. Rep. 6, 23259.
Yang, K., Liu, Y., Liang, L., Li, Z., Qin, Q., Nie, X., and Wang, S. 2017. The high-affinity phosphodiesterase PdeH regulates development and aflatoxin biosynthesis in Aspergillus flavus. Fungal Genet. Biol. 101, 7–19.
Zhang, S., Yue, Y., Sheng, L., Wu, Y., Fan, G., Li, A., Hu, X., Shangguan, M., and Wei, C. 2013. Pasmir: A literature-curated database for miRNA molecular regulation in plant response to abiotic stress. BMC Plant Biol. 13, 33.
Zhi, Q.Q., Li, J.Y., Liu, Q.Y., and He, Z.M. 2017. A cytosine methyltransferase ortholog dmtA is involved in the sensitivity of Aspergillus flavus to environmental stresses. Fungal Biol. 121, 501–514.
Zhu, K.J., Zhou, X., Yan, Y.P., Mo, H.M., Xie, Y.F., Cheng, B.J., and Fan, J. 2017. Cleavage of fusion proteins on the affinity resins using the TEV protease variant. Protein Expr. Purif. 131, 27–33.